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培地学シリーズ4

 

 大川微生物培地研究所 所長 大川三郎

大川先生の略歴

https://www.facebook.com/ohkawa.saburo

 

はじめに

サルモネラ用培地としてRV培地、TT培地等の選択増菌培地やSS寒天培地、Modified SS寒天培地、XLD寒天培地、ヘクトン・エンテリック寒天培地(HE)、DHL寒天培地、亜硫酸ビスマス(BS)寒天培地、スルファピリジン添加ブリリアントグリーン寒天培地(BGS)、MLCB寒天培地、CHROMagar-Salmonella寒天培地、dmLIA寒天培地、DOXサルモネラ培地等の選択培地が多種類ある。

米国ではこのうちBGS寒天培地、XLD寒天培地、HE寒天、dmLIA寒天培地が多くの施設で使用されている。

我が国ではサルモネラ選択培地として①<硫化水素を検出する培地>DHL寒天培地、MLCB寒天培地、XLD寒天培地②<硫化水素の検出系ではない培地>CHROMagar-Salmonella寒天培地等の酵素基質を用いた培地、BGS寒天培地が記載されている。このうちDHL寒天培地が最も一般的に使用されている。今回はDHL寒天培地について紹介する。

 

DHL寒天培地(Desoxycholate hydrogen sulfide-lactose agar

oh4.jpg

1.特徴

DHL寒天培地は坂崎らによりデオキシコレート寒天培地を改良したサルモネラ・赤痢菌の選択培地である。

本培地の特徴は鑑別用の炭水化物を、従来から用いられている乳糖に白糖を加えたことにより

①乳糖、白糖非分解菌と乳糖分解菌、白糖分解菌を区別が区別できる。チオ硫酸ナトリウムを添加したこと

②硫化水素産生菌と非産生菌の区別ができる(サルモネラの鑑別が容易)。全体的な栄養成分の改良により

③従来の腸内細菌選択培地では発育できなかった一部のサルモネラ<ヒナ白痢菌や家禽チフス菌>の発育が可能であることである。


2.組成(精製水1000mlに対して)

 

カゼイン膵消化ペプトン  10g
カゼイン酸水解ペプトン 5g
獣肉ペプトン 5g
牛肉エキス 3g
乳糖 10g
白糖 10g
デオキシコール酸ナトリウム 1g
チオ硫酸ナトリウム 2g
クエン酸鉄アンモニウム 1g
クエン酸ナトリウム 1g
中性紅 30mg
寒天 15g

 pH 7.0±0.2

 

3.原理

カゼイン膵消化ペプトン・カゼイン酸水解物ペプトン・獣肉ペプトン

細菌が発育するために必要な栄養素は

①窒素源
②炭素源

である。細菌は蛋白質を分解する能力がないので、タンパク質をポリペプチド・ペプチドの型まで消化すると細菌が分解することができる。

この蛋白を消化または分解した物質をペプトンと言う。ペプトンの種類としてはカゼインペプトン・大豆ペプトン・獣肉ペプトン、心筋ペプトン・ゼラチンペプトン等があるが、本培地ではカゼインペプトン(膵臓のパンクレアチン消化)とカゼイン酸水解ペプトン・獣肉ペプトン(獣肉ペプシン消化)が用いられている。獣肉ペプトンは栄養学的(アミノ酸・ビタミン・炭水化物などの含有量)に優れているために選択性の強い培地には必須のペプトンである。カゼインペプトンは経済的に優れているので基礎ペプトンとして使用されている。カゼイン酸水解ペプトンが何故使用されているのか?理解できない。(謎の組成だと思う。)

牛肉エキス

牛肉エキスは炭素・窒素源としてよりも,ビタミン・核酸・アミノ酸・有機酸・ミネラル等が豊富に含まれるために生育促進物質を補う目的で用いられている。牛肉エキスは、肉を水で浸出したものを(加熱して)濃縮したものである.濃縮時に熱による成分の変性が起こっており,高濃度で使用すると微生物の生育を阻害することがあるので,通常0.3–0.5%程度の濃度で使用される。

乳糖・白糖

培地中に含まれる乳糖・白糖は

①エネルギー獲得のための炭素源として
②炭水化物の分解による菌種の鑑別

の目的である。本培地では乳糖分解菌や白糖分解菌と乳糖・白糖非分解菌を鑑別することが目的である。即ち、サルモネラ、赤痢菌は乳糖、白糖ともに非分解であるのに対して他の腸内細菌はいずれかの糖または両方の糖を分解する。このために両者を区別できる。

デオキシコール酸ナトリウム

デソキシコール酸ナトリウムは胆汁酸塩の1種でアニオン界面活性剤である。目的は

①グラム陽性菌、酵母用真菌の発育を阻止(グラム陽性菌はペプチドグリカン層が厚く、細胞外膜がないために界面活性剤により溶菌されるために発育ができないがグラム陰性菌はペプチドグリカン層が薄く、細胞外膜が厚いために溶菌されないために発育できる。)

②プロテウスの遊走を阻止することである。胆汁酸塩としてデオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、タウルコール酸ナトリウムが培地で利用されるが、デオキシココール酸ナトリウムはこれらの胆汁酸塩の中では最も選択力は強いが、培地中では不安定な物質である。そのために過剰な加熱や急激な温度変化等で結晶が析出しやすい。そのために一般的にはデオキシコール酸ナトリウム:コール酸=6:4の割合混合した胆汁酸塩を使用されるのが一般的である。

クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム

クエン酸鉄アンモニウムは析出した胆汁酸を中和して無毒化し、クエン酸ナトリウムはデオキシコール酸ナトリウムの培地中での溶解度を高める。同時にグラム陽性菌の発育を抑制する。

チオ硫酸ナトリウム

チオ硫酸ナトリウムはイオウ源として利用し、硫化水素を産生する。硫化水素は培地中のクエン酸鉄アンモニウムと反応して黒色の硫化鉄(FeS)を産生するため、黒色に着色した集落の存在から硫化水素産生菌の鑑別ができる。Na223 ⇒ H2S + Fe2+ → FeS

この反応はpHに大きく影響され、pHが低い場合は硫化水素の産生が抑制される。つまり、硫化水素産生菌であっても、低pHの時は硫化鉄産生による黒色集落を形成しない。

⇒乳糖・白糖分解菌は硫化水素産生しても黒色コロニーは形成できない。

中性紅

中性紅はpHの変化によって変色する色素であり、pH指示薬と言う。変色域はpH6.8以下で赤色、pH8.0以上は黄色である。培地に発育したグラム陰性桿菌のコロニーは乳糖・白糖分解菌は乳酸を産生するためにpH 指示薬である中性紅が赤変する。さらにデオキシコール酸ナトリウムは強酸性では不溶性のデオキシコール酸となり、中性紅と結合する。従って、混濁した赤色コロニーを形成する。乳糖・白糖を分解できない菌は培地中のペプトンの分解のみで、アルカリ性になるので、無色の透明のコロニーを形成する。

寒天

寒天は培地の固形化剤である。原料は海藻であるテングサ、オゴノリである。細菌検査培地としてはオゴノリが原料として使用されている。(安価であるから)寒天の主成分はアガロースで糖が直鎖状につながっており、細菌には分解されにくい構造になっている。寒天の内部に水分子を内包しやすく、多量の水を吸収してスポンジ状の構造を形成する。水分を蓄えることができ、栄養分をその中に保持しておける。そのため、微生物の培地に適する。寒天を加熱していくと解ける温度を融点、また解けた寒天が固まる温度を凝固点と言うが、寒天は融点が85~93℃、凝固点が33~45℃である。これも寒天に混ぜる成分により変動する。良い培地か否かは寒天の品質が重要である。寒天の品質とは透明度、ゼリー強度、粘度、保水力が優れていることである。

 

4.使用法

①  選択増菌培地(RV・TT培地等)で42℃、18-20時間培養。

②  培養液から1白金耳を採取し、DHL寒天培地に画線塗抹する。

③  35℃±2℃の孵卵器で20±2時間培養する。

④  発育したコロニーの中から黒色コロニーの有無を確認。

⑤  黒色コロニーについては成書に従いサルモネラの同定をする。

 

5、<定量培養> #定性法で陽性の場合は実施する

⑥  食品の10%乳剤を10 倍段階希釈する。

⑦  各希釈段階の 0.1 ml をDHL寒天培地上に滴下し、コンラージ棒で広げる。

⑧  37℃で24時間培養する。

⑨  *硫化水素(+)集落の数をカウントし、1g 当たりの菌数を算出する。

*同定が必要です

 

6.培地の限界

1. 硫化水素非産生のサルモネラは黒色のコロニーを形成しない。サルモネラのすべてが黒色コロニーを形成することではない。サルモネラの中でチフス菌、パラチフスA菌等で硫化水素を産生しないか?あるいは産生が非常に弱い菌が存在する。

2、サルモネラ以外の菌でサルモネラと同様の黒色コロニーを形成する。サルモネラ以外の硫化水素産生菌ではCitrobacter freundii、Proteus vulgaris、P.mirabilisの腸内細菌3菌種では、サルモネラと同様培地上で硫化水素を産生することがある。理由は白糖非分解、または白糖は分解できるが分解力が弱いからである。(白糖分解が強い場合は硫化水素産生能力があっても黒色コロニーは形成しない)

3、試験培養液中のサルモネラの菌数が少ない場合では他菌のオーバーグロスにより検出できないことがある。培地の選択性(サルモネラ以外の細菌を阻止する力)が低いために大腸菌等の腸内細菌が多数存在し、サルモネラが少数の場合は検出できないことがある。

4、腸球菌がエルシニア菌に類似したコロニーとなる。この培地はデオキシコレートの含有量を低く抑えているために腸球菌の発育を完全に抑えることができない。腸球菌は乳糖分解であるために赤いコロニーを形成する。

5、緑膿菌等のブドウ糖非醗酵グラム陰性桿菌は本培地でも良好に発育する。とくにPseudomonas putrefaciensは硫化水素産生するためにサルモネラと同様のコロニーを形成する。他の非ブドウ糖醗酵菌は無色透明のコロニー、薄いピンクのコロニーを形成する。

5.食品中に存在するサルモネラの損傷菌は発育不良である。食品中の細菌は加熱、乾燥、凍結や製造工程により細胞膜・細胞壁がダメージを受けると(損傷菌)本培地に含まれているデオキシコレートの影響を受けやすいために発育が不良になる。正しいサルモネラ菌数の測定ができない場合がある。その理由は”損傷菌”対策のための成分が含まれていないからである。*食品加工によってサルモネラが損傷, 休眠状態, または少数汚染であることなどが考慮されるため, 選択増菌培養に先立ち, 菌の活性化, 修復および増菌の目的で前増菌培養を行うことと記載されている。<食品衛生検査指針 (2004)>

6.オートクレーブ滅菌や必要以上に加熱した培地は①選択性が悪くなる②寒天のゲル強度が低下する。

 

参考文献; 

島田俊雄:食品衛生検査指針 微生物編 日本食品衛生協会(2004)

森田幸雄:モダンメディア 56巻11号 2010

友近健一:防菌防黴学誌、30:85-90 2002.

坂崎利一:新 細菌培地学講座 近代出版 1988

Cassar :P.J Clin Microbiol. ;41(7):3229-32. 2003

村上光一:福岡県保健衛生研究所年報第37号,77-80 2010

 

 

 

 

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